马耳他骑士团与马耳他共和国在今天是两个没有关系的政治实体。然而从名字上我们就能知道，二者在历史上有关系。马耳他骑士团的全名是“耶路撒冷、罗得岛及马耳他圣约翰主权军事医院骑士团”，简称“医院骑士团”或“马耳他骑士团”。这么长的名字本身就是骑士团历史的浓缩。
马耳他骑士团的前身是著名的医院骑士团，它成立于 1099 年第一次十字军东征之后。当时法国贵族在耶路撒冷的施洗者圣约翰教堂附近的医院里成立，主要目的是照料伤患和朝圣者，并保护医院设施，故而这个骑士团被称为“耶路撒冷圣约翰医院骑士团”。
1120 年，法国人雷蒙·杜·皮伊继承首领位置，在他的带领下医院骑士团逐渐从保护朝圣者的医生、慈善修士转变为骑士和职业军人。同时，作为修会僧侣，医院骑士团远比普通十字军士兵更安贫乐道、纪律严明、吃苦耐劳，战斗力更强。
很快骑士团就成为耶路撒冷王国的重要军事力量，甚至能够影响王国的政局。这一时期医院骑士团与圣殿骑士团、条顿骑士团并称三大骑士团，在耶路撒冷王国拥有 7 座大要塞，140 多座其它建筑。
随后骑士团一直坚持到 1291 年才放弃巴勒斯坦并前往塞浦路斯。他们获得了塞浦路斯国王赐予的科洛西城堡及附近的甘蔗种植园和糖厂。
1309 年骑士团从拜占庭帝国手中夺取了罗德岛及周围岛屿。此后骑士团的名称又加入罗德岛。在这里，骑士团用海军阻止了穆斯林向东地中海地区的扩张。当 1453 年君士坦丁堡落入土耳其人的手里时，罗得岛是整个东地中海地区唯一的基督教力量。
1798 年 6 月 11 日，出任法国埃及方面军司令的拿破仑在进军埃及的途中取道马耳他。在强势的攻击下医院骑士团投降，拿破仑占领马耳他岛。岛上的修道院和教堂被法军洗劫，骑士团成员便四散开来，多数去往了俄国。俄国沙皇保罗一世承诺给予抵达俄国的骑士团成员庇护，骑士团则选举保罗一世为新的骑士团大团长。
离开了马耳他岛之后，骑士团就此失去了领土，但仍作为一个组织存在，1802 年，骑士团对马耳他岛的主权通过《亚眠条约》(Treaty of Amiens)得到英法等国承认，但从未被允许回到岛上。1834 年，医院骑士团在罗马重建总部，终于再次稳定下来。这时骑士团的军事使命已经完结，此后主要从事慈善事业。
自此，“马耳他”只留在了骑士团的名称中，而骑士团与马耳他岛已经没有实际关系。